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Estandarización y Fases en la tecnica Inmunohistoquímica (IHQ)

La comisión de tinciones biológicas y la FDA ha elaborado un protocolo llamado “Total Test” donde contempla con rigurosidad todos los factores que hay que controlar en un laboratorio para conseguir una estandarización en inmunohistoquímica.


Basada en la alta especificidad y afinidad de la reacción antígeno-anticuerpo la IHQ permite, mediante el empleo de anticuerpos específicos y sistemas de detección, determinar la expresión de biomarcadores (proteínas). Se puede realizar sobre tejidos en fresco, fijados en formol y coágulos citológicos incluidos en parafina, permitiendo la evaluación simultánea de la morfología. Es una técnica compleja, en la cual el resultado final está influenciado por múltiples parámetros de las fases preanalítica, analítica y post-analítica. Dependiendo de la selección y el rendimiento de estos parámetros, el resultado final de la técnica utilizando el mismo anticuerpo primario puede mostrar un rango de negativo a positivo para el antígeno objetivo. Para que su empleo sea de máxima utilidad y los resultados obtenidos sean reproducibles y confiables es imprescindible la estandarización de cada uno de los pasos o fases desde la obtención de la muestra, con la adecuada fijación de los tejidos, hasta el ajuste de la técnica, lectura y valorización de los resultados obtenidos a los criterios establecidos mediante controles de calidad internos y externos. Una adecuada técnica de IHQ debe asentarse en una base sólida. En este sentido deberá prestarse especial atención a los factores que la influyen de manera más importante:



La FDA y el NIST elaboraron un protocolo para la estandarización y además establecieron la necesidad de uso de controles universales. Hay dos factores principales que dificultan una buena estandarización en la rutina del laboratorio de inmunohistoquímica:


• La creciente disponibilidad de diversos reactivos para la inmunohistoquímica, la enorme variedad de métodos de tinción que proporcionan y por tanto con sus consiguientes métodos de interpretación diferentes. De ahí la necesidad de usar unos controles universales, algo análogo a los controles de calibración de los test de ELISA

• El clásico método de fijación en formalina y conservación en parafina. Muy útil para una buena conservación morfológica del tejido, pero afecta muy negativamente a la antigenicidad de las moléculas del tejido. La enorme variación en protocolos de fijación en parafina entre los distintos laboratorios y dentro del mismo laboratorio, entre un tipo de pieza quirúrgica u otra, constituyen un problema porque contribuyen a una baja reproducibilidad de los análisis inmunohistoquímicos inter e intralaboratorio.

Para afrontar este problema de alta variabilidad de protocolos y baja reproducibilidad, los proveedores han trabajado en ofrecer diferentes soluciones: mejor fijación, mejora en los métodos de recuperación antigénica, mejora los reactivos, métodos de detección y revelados más sensibles, desarrollo de controles o referencias estándar. Con todo esto lo que se pretende es asegurar una calidad buena y uniforme, con un buen nivel de reproducibilidad y confianza suficiente para permitir comparaciones de resultados entre laboratorios, especialmente en análisis semicuantitativos).

Para conseguir una máxima estandarización todos los laboratorios deberían seguir estrictamente cada uno de los pasos del Total Test: mismas condiciones de fijación (tiempo y reactivos), misma recuperación antigénica, mismos anticuerpos y sistema de visualización, mismos controles, etc.


FASE PREANALÍTICA

La mayoría de las variables preanalíticas impactan en el resultado de la técnica de inmunohistoquimica. La tasa de perdida de integridad de epítopes antigénicos depende de ellas. Una fijación inadecuada impide cualquier resultado fiable y la falta de reproducibilidad de la técnica de inmunohistoquimica es en parte consecuencia de aquella.


FASE ANALÍTICA

La fase analítica comienza con el desparafinado y termina con el montado de los cortes

contracoloreados. Las variables de esta fase, las cuales a diferencia de las preanalíticas pueden

controlarse y modificarse dentro del laboratorio de patología, son:

1. Recuperación antigénica.

2. Bloqueo de enzimas endógenas.

3. Anticuerpos primarios.

4. Diluyentes.

5. Sistema de detección.

6. Enzimas y cromógenos.


FASE POSTANALÍTICA

Son todos los controles aolicados a los procesos para poder tener un resultado favorable. El control de calidad es indispensable en todo el proceso ya que dará confianza al momento de emitir diagnosticos

Los Controles de la técnica de IHQ pueden ser:

1. De reactivos

2. De tejidos

3. De temperatura

4. De Anticuerpos



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