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Fundamentos generales de las tinciones


Objetivo principal de la coloración

El fundamento de la coloración radica en la propiedad que poseen todos los tejidos para incorporar y fijar sustancias coloreadas. La coloración se basa en la afinidad particular de ciertos tejidos o formaciones celulares por una sustancia colorante determinada.

La primera coloración conocida fue por Van Leeuwenhoek en 1714, que pretendía observar fibras musculares estriadas empleando una solución de azafrán en vino. Posterior a esto se introdujeron colorantes como el carmín y la hematoxilina (Waldeyer, 1863).

Todo estudio cuidadoso de un tejido o de una lesión pide la ejecución de varias coloraciones diferentes.

Las coloraciones citológicas permiten un estudio más específico de estructuras celulares: núcleos, gránulos secretores, mitocondrias, citoplasma, etc.

Hay dos tipos de colorante:

• Colorantes naturales: se encuentran en la naturaleza, por ejemplo: hematoxilina, carmín, safranina, etc.

• Colorantes artificiales: la mayoría son derivados de la anilina.

Existen diferentes formas de teñir en cuanto al mecanismo de acción de coloración,

y se utilizan tanto:

• Técnicas de inmersión: consiste en colocar la batería de tinción y en cada uno de los frascos introducimos el líquido y colorantes que utilizamos en la tinción, sumergiendo posteriormente la preparación en ellos.

• Técnicas de vertido: consisten en verter el colorante sobre la preparación, como por ejemplo en microbiología.


Naturaleza química de los colorantes

Los materiales colorantes son sustancias que son incoloras en el espectro visible y absorben luz en el ultravioleta. A este grupo pertenecen sustancias aromáticas el benzol, la naftalina y el antraceno. Son incoloras al ojo humano, pero por sustitución se transforman en sustancias coloreadas.

La absorción ultravioleta pasa a la zona del espectro visible al añadir nuevos grupos químicos en la molécula; estos grupos son los denominados cromóforos, y su labor la de dar color a la sustancia. La combinación de un cromóforo con un anillo aromático da origen a un cromógeno, que es en realidad el componente colorante de las materias colorantes. En determinadas ocasiones el color puede seguir oculto a la vista, entonces se adiciona un auxocromo, que aumenta el color y lo hace visible. Cromóforo + anillo bencénico (auxocromo) = cromógeno. Los principales grupos cromóforos conocidos son los radicales: etileno, carbonilo, imino, nitros y cualquier anillo derivado de las quinonas.


Teoría del proceso de coloración

• Coloraciones químicas: la reacción entre el colorante y el sustrato se

efectúa bajo un proceso químico bien definido (histoquímica).

• Coloraciones físicas: se incorpora el colorante por disolución en las estructuras tisulares. Siguiendo las reglas de la difusión, pasan de la solución colorante hacia las estructuras celulares de su predilección. El proceso de impregnación también se basa en mecanismos físicos; las estructuras más densas son las que más se tiñen al contener más huecos capaces de alojar al colorante. Por lo tanto, hay que decir que la penetración del colorante depende de los huecos tisulares y del grado de dispersión. Las soluciones colorantes poco dispersas van a necesitar más tiempo para penetrar en los tejidos densos.

• Coloraciones por mecanismos físico-químicos: se distingue la electro- absorción y adsorción por tensión artificial. Para que se produzca la electro- absorción es necesario que el colorante y el material teñir tengan cargas negativas de polaridad opuesta. La adsorción por tensión superficial es debida a la asperidad de la superficie de un cuerpo que hace que una sustancia quede adherida. Mientras que las coloraciones por mecanismos físicos se basan en la difusión del colorante, en las coloraciones por adsorción se origina precipitados



Clasificación de los colorantes según sus grupos auxocromos y su apetencia tisular

• Básicos: son moléculas básicas que tiñen estructuras de tipo ácido como los ácidos nucleicos. Dentro de este grupo están la fucsina básica, azul de metileno, azul de toluidina, verde de metilo, etc.

• Ácidos: son moléculas ácidas que tiñen estructuras básicas como el citoplasma. Dentro de este grupo están la eosina, eritrosina, naranja ácida (orange), verde brillante o verde luz y fucsina ácida.

• Neutros: son sales cuya propiedad colorante va unidad tanto al colorante básico como al ácido. Dentro de este grupo están el eosinato, azul de metileno y panóptico rápido.

• Colorantes indiferentes: diferente solubilidad; no tiñen por unión de una molécula u otra, sino que son solubles a la sustancia que tiñen.

• Colorantes metacromáticos: en condiciones normales la mayor parte de los tejidos tienden a teñirse con un tono semejante al del colorante utilizado. Esta propiedad recibe el nombre de ortocromasia. Al utilizar ciertos colorantes básicos derivados de la anilina, algunas estructuras tisulares se tiñen con tonos diferentes al que cabría esperar (ej.: los gránulos de los mastocitos se tiñen con azul de metileno o de toluidina y dan una coloración roja). Este fenómeno se conoce como metacromasia, y las estructuras así teñidas, cromótropas. Los colorantes metacromáticos son sustancias químicamente puras y no de carácter salino. La explicación para este fenómeno es que se produce polimerización entre las moléculas de colorante adyacentes a la estructura que se va a teñir.


Clasificación de los colorantes según sus grupos cromóforos

• Colorantes nitrados y nitrosados: son nitros (−𝑵𝑶𝟐)) o nitrosoderivados

(-N=O) del benceno o naftaleno con grupos hidroxilos, amino, etc. Ej. Ácido pícrico.

• Colorantes azoicos: contienen el cromóforo –N = N- ligado a anillos de benceno o antraceno; son colorantes ácidos en su mayoría. Se dividen en monoazoicos (Orange G, Ponceau de xilidina y cromotropo 2R) o diazoicos (Sudán rojo y negro, rojo Congo, escarlata de Biebrich y azul tripán).

• Colorantes derivados de la antraquinona: se obtiene a partir de la oxidación del antraceno para formar anillos quinónicos (rojo de alizarina S).

• Colorantes derivados del difenilmetano (auramina) y del trifenilmetano (fucsinas, verde ligero): estos colorantes dependiendo de

su auxocromo, serán ácidos o básicos.

• Colorantes derivados de las ftalocianinas: son el azul o amarillo alcián, que poseen de 2-4 grupos de isotiouronio alrededor de un átomo de cobre.

• Colorantes derivados del xanteno: posee cromóforos variables, como la pironina, rodamina y sulfaftaleína.

• Colorantes derivados de la acridina: contienen cromóforo naranja de acridina.

• Colorantes derivados de iminas quinónicas: tienen dos grupos cromóforos, los cuales hacen que estos colorantes se clasifiquen en:

- Derivados oxacínicos.

- Derivados tiacínicos.

- Derivados acínicos.

Clases de coloraciones

• Coloraciones topográficas: dan una visión en conjunto de las estructuras de un tejido o de la arquitectura de una lesión. Son coloraciones de rutina, como la hematoxilina.

• Coloraciones citológicas: permiten el estudio íntimo de las estructuras celulares. Las principales son: eritrosina naranja, azul de toluidina, azocarmín, Papanicolaou.

• Coloraciones histoquímicas: procurarán poner menos en evidencia una sustancia química que una función química determinada.

• Coloraciones estructurales: ponen en evidencia los componentes íntimos de ciertas estructuras tisulares, como las fibras elásticas, fibras de Reticulina y neuroglia.

• Coloraciones ultraestructurales: ponen en evidencia las estructuras de microscopía electrónica, como el aparato de Golgi, las mitocondrias, etc.



Mecanismo de acción de los colorantes

Coloraciones simples directas

Se basan en la afinidad particular del/de los tejido/s o bien de la estructura celular por el colorante.

Estos procedimientos nos sirven tanto para tinciones de:

• Tejidos: el colorante tiene afinidad por un cierto tejido.

• Citología: teñir núcleo, coloración afinidad por los núcleos.

Coloraciones indirectas

Tras la aplicación de un mordiente, un mordiente es una sustancia que se utiliza para aumentar la captación selectiva de un determinado colorante, ayuda para la realización de la coloración. Puede aplicarse sobre el tejido o entran en la composición de los fijadores o del propio tejido.

Coloraciones progresivas

En ellas se detiene la coloración en el momento en que se ha obtenido el color deseado, por ejemplo: las coloraciones con azul de metileno o de toluidina.

Coloración regresiva seguidas de diferenciación

En ellas se prolonga la coloración hasta que el tejido quede sobrecoloreado y a continuación se utiliza un diferenciador que elimina el colorante de los tejidos que poseen poca afinidad por él; este proceso ha de servirse en muchas ocasiones del microscopio.

Prolongamos el tiempo de contacto del colorante sobre la estructura, utilizando posteriormente el diferenciador, que elimina el exceso de colorante en los tejidos donde este no tiene tanta afinidad.

Los diferenciadores más utilizados son:

• Alcoholes de alta concentración.

• Ácidos, como el clorhídrico y el pícrico.

• Mezclas de alcoholes y ácidos.

• Los alumbres, que se utilizan algunas veces como diferenciadores aparte de mordientes.

Coloración sobre piezas en bloque

Consiste en teñir la muestra antes de ser dividida en cortes; esta práctica está actualmente abandonada.


Tiempo de coloración

Los tiempos de coloración varían según:

• La naturaleza de la pieza.

• El grosor de los cortes.

• La calidad y la duración de la fijación.

• La marca del colorante.

• El grado de maduración de las soluciones.

• La temperatura ambiental.

Recomendaciones generales sobre las coloraciones:

• Conservar los colorantes en polvo, herméticamente cerrados, al abrigo de la luz

• Conservar las soluciones colorantes en frascos oscuros.

• Utilizar cristalería adecuada, lavada con agua destilada.

• Cambiar frecuentemente las soluciones colorantes y los medios diferenciadores.

• Secar cuidadosamente el portaobjetos.

• Cuidar y prolongar los lavados, especialmente después de los mordientes y las tinciones.

• Vigilar la tinción al microscopio.

• Usar cubetas para las coloraciones de rutina.



Otros conceptos en coloración

Tinción física y tinción química

En tinción física, el colorante se disuelve en el sustrato. Por ejemplo, el Sudan III se disuelve en las grasas y es empleado para demostrar gotas lipídicas.

En una tinción química, el colorante interacciona químicamente con el sustrato a través de fuerzas de Van der Waals, puentes de hidrógenos, enlaces covalentes o enlaces electrostáticos.

Tinción tricrómica

Las tinciones pueden ser simples cuando se utiliza un solo colorante o múltiples cuando se usan dos o más colorantes. En una tinción tricrómica se emplean tres colorantes, cada uno de ellos con unas particularidades, de tal manera que se consigue teñir con colores diferentes y estructuras diferentes, permitiendo así su rápida identificación en el microscopio.

Tinción supravital

Es aquella que se realiza sobre células frescas, con objeto de realizar una observación de las estructuras teñidas con las células vivas. Por ejemplo, se pueden teñir las mitocondrias de células vivas con el colorante verde jano y observarlas con el microscopio mientras las células permanecen vivas.

Tinción vital

Es aquel procedimiento por el cual un colorante no tóxico, como el carmín de litio o el azul tripán, se inyecta en un organismo vivo para estudiar procesos vitales de células capaces de acumularlo por pinocitosis o fagocitosis.

Tinción negativa

Esta tinción se basa en que el colorante no tiñe la estructura que se desea estudiar, de tal forma que la morfología externa o los contornos de esa estructura quedan delimitados por el propio colorante que se encuentra a su alrededor.

Tinción de cortes “en flotación”

Cuando se utilizan cortes gruesos de 30-50 micras mediante criostato, conviene realizar un determinado tipo de tinciones en “flotación”. Los cortes de tejido se mantendrán sumergidos en el interior de la solución colorante por ambas superficies. Este tipo de técnicas se realizan cuando se lleva a cabo técnicas de tinción histoenzimáticas o inmunocitoquímicas.

Tinción en placa

Es la que se realiza utilizando placas de cultivos celulares. La tinción se realiza sobre células que se han mantenido vivas en condiciones in vitro.

Tinción en bloque

En algunos tipos de impregnaciones metálicas, técnica de Golgi, etc., conviene realizar la tinción no sobre los cortes histológicos sino sobre la pieza o bloque de tejido. Para ello el bloque de tejido se sumerge en la solución colorante durante un tiempo determinado.


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