top of page

Técnicas de Detección de VPH moleculares en Perú

Por

Washington A. Ortiz Uribe

---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

Actualmente en el mercado peruano se encuentra casi un centenar de pruebas moleculares para la detección de VPH con técnicas estandarizadas, pero muchas de ellas no son reproducibles, motivo por el cual no ha sido validadas y carecen de pruebas de precisión y de fiabilidad. Por lo tanto, es necesario que estas pruebas para VPH tengan la máxima sensibilidad clínica sin comprometer la especificidad, y los laboratorios que lo realizan deben de saber:

¿Qué tipos de VPH se detectan con la prueba?

¿Cómo se presentan los resultados: positivo- negativo o por tipo de VPH?

¿Cuáles son los requerimientos y costos de los insumos y equipo?

¿Cuánto tiempo toma el procesamiento de la muestra?

¿Qué tipo de capacitación se requiere para procesar la prueba?

¿Cómo se controla la calidad de los resultados de la prueba?

¿Cuáles son las condiciones o arreglos con los distribuidores locales para la provisión de la prueba, incluyendo el precio?

Entre las técnicas empleadas para detección y genotipificación del VPH :

A.-Hybrid Capture 2 (HC2). Es un método semicuantitativo no radiactivo. Se basa en la capacidad de hibridación del DNA-VPH usando sonda de RNA que se complementa a una secuencia común para 13 tipos de VPH considerados de alto riesgo (16, 18, 31, 33, 35, 39, 45,51, 52, 56, 58, 59 y 68) que reaccionan con anticuerpos monoclonales específicos que revelaran el virus por quimioluminiscencia. Estas características hacen que esta técnica sea muy sensible, y de fácil adopción en los laboratorios de rutina y ensayos clínicos, además de ser una técnica aprobada por la FDA.

La técnica HC2 presenta las siguientes

Ventajas:

(1) fácil instalación y aplicación en los laboratorios de rutina;

(2) no requiere personal con experiencia en técnicas moleculares;

(3) presenta alta sensibilidad (96-98%), y (4) está Indicado en resultados de ASCUS.

Limitaciones o desventajas

(1)Primero, solo emite resultado positivo o negativo a VPH de alto riesgo, sin identificar el tipo viral específico

(2) Los resultados pueden ser hasta en un 8% falso negativo como consecuencia de una carga viral baja o por sustancias que interfieren en el ensayo, principalmente antifúngicos en crema o anticonceptivos en gel.

(3) La técnica puede presentar reacciones cruzadas con algunos tipos de VPH no oncogénicos

B.-Reacción en cadena de la polimerasa (PCR).

En la actualidad la PCR es el método más sensible para la detección de VPH; sin embargo, existen diferentes protocolos para detectar un amplio espectro de genotipos de VPH que utilizan partidores genéricos que reconocen secuencias específicas del genoma viral. Los protocolos, en su mayoría, usan juegos de oligonucleótidos dirigidos a la región del gen L1 altamente conservadora entre los tipos virales. Entre ellos destaca el uso de los oligonucleótidos GP5+/6+ y los MY09/11 degenerados (34-36). Para la tipificación de genotipos virales a partir de los productos de la amplificación, se utilizan distintos métodos:

a.- SouthernBlot, Hibridación Dot Blot, fragmentos de restricción de longitud polimórfica (RFLP), secuenciación y enzimoinmunoensayo. La PCR para VPH puede verse alterada por la presencia de diversas sustancias que inhiben la reacción de amplificación. Por estas razones, la mayoría de laboratorios han incorporado la amplificación de un control interno, por ejemplo, la beta-globina se utiliza en cada ensayo de PCR como un indicador para detectar la inhibición potencial y/o integridad de la muestra. Esto es particularmente importante para muestras de tejido conservado en parafina, donde puede haber degradación del DNA; por tanto, se recomienda evaluar previamente la integridad de la muestra.

Entre los sistemas con mayor sensibilidad

b.- PCR en tiempo real. Un método muy usado en estudios epidemiológicos y clínicos que permite estimar con gran precisión la carga viral. Asimismo, existen dos sistemas fundamentados en la PCR comúnmente utilizados para la detección de los genotipos del VPH (40,41).Aunque algunos genotipos del VPH pueden producir anormalidades citológicas, no todos tienen implicancia clínica en el desarrollo de una probable lesión maligna, por ello es importante contar con la genotipificación del VPH. Factores que influyen como predictores para el desarrollo de lesiones de alto grado, son las infecciones persistentes por un mismo tipo de VPH de alto riesgo

Pruebas de amplificación de ADN

La amplificación de genes mediante PCR permite obtener millones de copias a partir de un fragmento de ADN particular. Se han diseñado diferentes conjuntos de primers o cebadores, que en su mayoría han sido dirigidos hacia la región L1 y que permiten diferenciar, mediante sondas específicas, los tipos más frecuentes de VPH de alto, intermedio y bajo riesgo efectuando una hibridación en placa de los productos biotinilados previamente amplificados por PCR. Esta técnica es muy sensible, con un nivel de detección hasta de una copia viral. Sin embargo, debido a su alta sensibilidad, este método es muy susceptible a contaminación. En la actualidad existen, además de las PCR genéricas, aquellas tipo-específicas que reportan algunos tipos virales y las PCR múltiples que identifican varios fragmentos del genoma. Entre las pruebas se encuentran, entre otras, GP5+/GP6+, Cervista, Cobas, Abbott y GeneXpert.


COSTOS

INPPARES Av. Giuseppe Garibaldi 125, Jesús María. Altura de la cuadra 20 de la Av. Salaverry. Realiza el test Cobas: que además de detectar simultáneamente 14, de los 40 tipos de VPH brinda información de los tipos 16 y 18, causantes del cáncer de cuello uterino y el precio es de 283.5 soles (83 dólares)

En caso del Hospital esSalud-Pucallpa (seguro social) en el que laboro que es el área de microbiología realizamos PCR-RT con la maquina Gene X pert: X pert VPH assay que es una prueba cualitativa in vitro para realizar la determinación de la región E5 y E7 del VPH de 14 tipos de alto riesgo cuenta con 3 canales el primer canal es para el tipo 16 el segundo para el tipo 18 y 45 y el tercero para 11 tipos (31,33,35,39,51,52,56,58,59,66 y 68) las muestras procesadas son células cervicales recogidas en solución PreservCyt tomada por médicos ginecólogos y obstetras, el análisis tiene un tiempo de duración de 45 a 50 minutos, es gratuita a las aseguradas (el precio es de aproximadamente 100 dólares por prueba)

369 visualizaciones0 comentarios

Commentaires


bottom of page