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Técnicas Microfotográficas en anatomia patologica

El éxito de la consulta telemédica en histología y citología depende en gran medida de la correcta aplicación de la técnica fotográfica. Este articulo del blog proporciona una breve introducción sobre cómo crear imágenes digitales para telehistología y telecitología, independientemente de las marcas comerciales del microscopio, la cámara y el software necesario, ya que se necesitan los mismos conocimientos básicos para todos. Para obtener más información, consulte el libro completo de Douglas B. Murphy: Fundamentos de microscopía de luz e imágenes electrónicas, Wiley-Liss Inc., Nueva York, etc., 2001, 368 págs. 1. Equipo Necesario para Telepatología Un lugar apropiado de trabajo telepatológico incluye: • Microscopio

•Cámara adjunta al microscopio (Fig. 1)

•Adaptador, también disponible bajo pedido con nosotros • Computadora con software de microfotografía Hay varios proveedores independientes del equipo necesario. Los detalles son una cuestión de acuerdo con el proveedor local.


Equipo Necesario para Telepatología Digital
Equipo Necesario para Telepatología Digital

Figura 1. Para enfocar la cámara (A) debe estar conectada por un cable (B) con un monitor externo (C) si la cámara no es WIFI.


2. Comprobación del equipo de la cámara El primer paso es asegurarse de que 1. La cámara esté montada correctamente en el microscopio

2. La fuente de alimentación esté enchufada

3. La tarjeta de memoria esté en la cámara

4. La cámara esté conectada con la pantalla de video

5. El dial de modo esté en M ( manual)

La familiaridad con los componentes del microscopio es imprescindible para poder seguir esta introducción a la técnica de la microfotografía (fig. 2).

Componentes del Microscopio
Componentes del Microscopio

Figura 2. Componentes del Microscopio: 1. Adaptador para la cámara 2. Oculares

3.Objetivos 4. Porta diapositivas 5. Escritorio 6. Lente frontal del condensador. El diafragma del condensador se abre y se cierra por la rotación del anillo metálico 7. Tornillos de ajuste del condensador 8. Fuente de luz y apertura basal


El procedimiento de microfotografía comprende los siguientes pasos indispensables: • Colocar el portaobjetos de vidrio sobre la mesa del microscopio y fijarlo con el soporte para portaobjetos.

• Selección del campo de visión desde el que se tomará la imagen.

• Enfoque del campo de visión preliminar.

• Iluminación Koehler y control de enfoque

3. Selección adecuada del campo de visión para microfotografía Generalmente, las muestras histológicas y citológicas exigen los mismos procedimientos fotográficos de ajuste del microscopio y la cámara. Las diferencias resultan de las diferentes propiedades de las muestras histológicas y citológicas: las secciones histológicas apropiadas suelen tener un grosor uniforme, la textura del tejido está casi intacta y sus elementos se encuentran al mismo nivel. Por el contrario, los elementos relevantes de las muestras citológicas pueden estar dispersos entre las células normales, distribuidos irregularmente en el frotis, a menudo no en una sola capa y no todos ubicados al mismo nivel, por lo que el enfoque puede ser un desafío.

Figura 3. En esta imagen, el área azul representa el componente epitelial de una muestra histológica de tumor; el área naranja representa el tejido estromal. A: Selección de áreas tomadas a bajo aumento con un objetivo ÿ 10x, dando una visión general de las partes más importantes de la muestra. B: Selección de un área para tomar una imagen a mayor aumento.
Figura 3. En esta imagen, el área azul representa el componente epitelial de una muestra histológica de tumor; el área naranja representa el tejido estromal. A: Selección de áreas tomadas a bajo aumento con un objetivo ÿ 10x, dando una visión general de las partes más importantes de la muestra. B: Selección de un área para tomar una imagen a mayor aumento.

• Las áreas de los cortes histológicos deben seleccionarse cuidadosamente como se muestra en la fig. • Las muestras citológicas primero deben examinarse minuciosamente y las células en cuestión marcado con un rotulador como de costumbre. En la Figura 3. El área azul representa el componente epitelial de una muestra histológica de tumor; el área naranja representa el tejido estromal. A: Selección de áreas tomadas a bajo aumento con un objetivo ÿ 10x, dando una visión general de las partes más importantes de la muestra. B: Selección de un área para tomar una imagen a mayor aumento.



Figura 3. Ilustración del procedimiento de Koehler
Figura 3. Ilustración del procedimiento de Koehler

4. Iluminación Koehler El haz de luz puede dispersarse al pasar las lentes del microscopio. La luz dispersada puede desenfocar los detalles de la imagen microscópica. Por lo tanto, el haz de luz debe centrarse principalmente cada vez antes de la microfotografía y después de cada cambio de objetivo: esto se hace mediante la iluminación de Koehler, que optimiza la trayectoria óptica de un microscopio para producir una luz homogéneamente brillante sin artefactos ni deslumbramiento: 1. Coloque la lente frontal del condensador del microscopio en la posición superior si desea realizar la corrección con uno de los objetivos 10x, 20x, 40x o 100x. Baje la lente frontal, si la corrección debe realizarse con objetivos por debajo de 10x. 2. Monte un portaobjetos en la mesa del microscopio y enfoque la sección histológica o el frotis mirando a través de las lentes oculares del microscopio. 3. Cierre la apertura en la base del microscopio girando el anillo en la fuente de luz. Mirando a través del microscopio, ves un círculo brillante. Si el círculo no está en el centro del campo visual, gire con cuidado los dos tornillos en la parte inferior del condensador hasta que el círculo quede centrado. 4. Mueva el condensador hacia arriba y hacia abajo hasta que el margen del círculo sea lo más nítido posible. 5. Abra la abertura en la base del microscopio hasta que el margen negro el círculo simplemente desaparece detrás del margen del campo de visión 6. Finalmente, abra completamente la apertura del diafragma del condensador, luego ciérrelo suavemente hasta que vea un ligero efecto en el brillo del campo visual. Si cierra demasiado la abertura, los bordes del tejido y las estructuras celulares aparecen con doble contorno. Con una apertura óptima del diafragma, la estructura de la cromatina de los núcleos estará bien representada en las imágenes; abriendo demasiado el diafragma, la estructura de la cromatina nuclear aparecerá borrosa. Todo el procedimiento está bien demostrado por varios cortometrajes en nuestro canal de Youtube.

5. Control de enfoque Antes de tomar una fotografía, compruebe siempre el enfoque en el monitor externo (pantalla). Es absolutamente necesario utilizar el monitor externo para enfocar, ya que el enfoque del ocular se ajusta al ojo del observador y, por lo tanto, puede diferir considerablemente del enfoque de la cámara. Especialmente las personas que usan anteojos generalmente no tienen una buena oportunidad de tomar imágenes, que están bien enfocadas si no enfocan en la pantalla. Tampoco es recomendable utilizar la pantalla de la parte posterior de la cámara para enfocar, ya que suele ser demasiado pequeña para juzgar con fiabilidad el poder de resolución. En el caso de agregados de células tridimensionales, cuando no todas las células y sus núcleos estén al mismo nivel, tome una serie de imágenes en diferentes niveles de enfoque.

Importante ¡El enfoque y la corrección de Koehler deben realizarse a través de la pantalla! Esta es la única manera de revelar perfectamente los detalles finos de la estructura de la cromatina nuclear, los gránulos citoplasmáticos y las bacterias. 6. Configuración del tiempo de exposición Siga las instrucciones del fabricante de su microscopio y su programa de software. El tiempo de exposición y la intensidad de la luz no deben exceder los siguientes valores:


Tiempo de exposición: 1/30 o 1/60 seg 3,0 Apertura F: – 4,0


Si el tiempo de exposición o los valores de apertura son diferentes de estos valores óptimos, brinde más o menos luz. En la mayoría de los casos, el tiempo de exposición óptimo es de 1/30 s con apertura F 4.0. 7. Configuración del balance de blancos

Para la reproducción del color del sonido es fundamental hacer el balance de blancos de tu cámara. Este procedimiento debe realizarse siempre antes de tomar una imagen si previamente se ha cambiado la iluminación y/o el objetivo. ¡Cualquier cambio de la iluminación del microscopio cambia los colores! El balance de blancos se debe realizar después de configurar la intensidad de luz y el tiempo de exposición adecuados. Los resultados del balance automático de blancos o de color son en su mayoría menos óptimos que los del bien dirigido procedimiento manual, que consta de tres pasos, como se muestra en la fig. 4. Sigue los consejos de tu programa de fotografía.


 Figura 4: Los diferentes pasos para el balance de blancos.
Figura 4: Los diferentes pasos para el balance de blancos.

Importante Después de este procedimiento, no se debe cambiar la iluminación ni el objetivo. Si cambia la iluminación ahora, el balance de blancos ya no será apropiado y tendrá que ajustarlo de nuevo. 8. Corrección de sombreado

La interacción entre los objetos, la iluminación y la cámara a menudo genera sombras significativas en el campo de visión, lo que puede afectar la calidad de la imagen. El sombreado puede deberse a una iluminación no uniforme, una sensibilidad de la cámara no uniforme o incluso suciedad y polvo en las superficies de cristal (lente). Algunos programas de fotografía ofrecen la posibilidad de eliminar estas sombras. La corrección debe hacerse para cada objetivo por separado en ausencia de una diapositiva. La iluminación debe ajustarse hasta que las sombras se hagan evidentes. Luego haga clic en el botón para la corrección de sombras en el menú del programa de fotografía.


Figura 5 ilustra los defectos más comunes de las microfotografías
Figura 5 ilustra los defectos más comunes de las microfotografías

9. Consejos especiales para optimizar las imágenes En cualquier caso, las imágenes deben tomarse utilizando al menos dos objetivos: • De las secciones histológicas, primero tome microfotografías para dar una visión general de las diferentes áreas del espécimen. Se recomiendan como máximo cuatro imágenes con objetivo 10x. • A partir de frotis citológicos, tome una fotografía con el mismo objetivo 10x o 20x para documentar la celularidad de la muestra. • Luego tome las micro-fotos para demostrar los detalles morfológicos con un objetivo 20x dependiendo del tamaño del objeto. • En cuanto a los cortes histológicos: si se sospecha un tumor, se debe documentar cuidadosamente la relación tumor/estroma (relación epitelio/estroma); esto es especialmente necesario en los casos en que se sospecha un carcinoma que surge del epitelio escamoso, el urotelio o la membrana mucosa intestinal. • Respecto a los frotis citológicos: Tome fotografías de las células atípicas utilizando objetivos 40x, 63x o 100x según el tamaño de las células. En cualquier caso, la estructura de la cromatina nuclear debe ser bien reconocible. Si los elementos (células tumorales o agregados de células), de los que desea tomar una foto, son demasiado grandes para reducirlos con la ampliación hasta que el elemento llene el campo visual. • Para frotis de sangre secada al aire teñidos con Giemsa, utilice siempre la mayor aumento, es decir, el objetivo 100x con aceite de inmersión! En la mayoría de los casos, será suficiente un máximo de diez microfotografías (imágenes generales incluidas). Importante Usar objetivos de 63x o 100x para demostrar pequeños detalles y las características de células pequeñas como las células linfoides es mucho mejor que tomar las imágenes con obj. 20x o 40x y posteriores aumentos con un programa informático.

10. Problemas comunes La Figura 5 ilustra los defectos más comunes de las microfotografías, que pueden imposibilitar cualquier consulta telemédica y da consejos para superarlos:

A: Imagen desenfocada. Posible causa de la falla: No se ha realizado el enfoque en el monitor. B: Balance de blancos omitido. El fondo aparece descolorido de color amarillo verdoso. Con ello, el contraste también se ve afectado y la estructura de la cromatina nuclear y otros detalles son difíciles de reconocer. Se recomienda un balance de blancos dirigido.

C: Tiempo de exposición inadecuado y/o intensidad de luz inadecuada. Corrección: Controlar tiempo de exposición. Si es correcto, da un poco más de luz. D: Signos de corrección de Koehler inapropiada. Reconocible por la sombra que llega al centro de la imagen.

11. Limpieza del Microscopio

Las lentes del microscopio sucias también pueden influir negativamente en la obtención de imágenes. Las herramientas recomendadas para limpiar las lentes son puntas de algodón y/o tejido no esponjoso (tejido de celulosa/gasa) humedecido con éter-etanol.

Procedimiento • Las lentes y los componentes de vidrio del microscopio se limpian comenzando por los oculares y descendiendo hasta la fuente de luz en la base del microscopio. • El polvo y los fragmentos de vidrio se limpian del escritorio de objetos con una gasa no esponjosa humedecida en éter-alcohol. No utilice un cepillo soplador, que solo distribuye las partículas de polvo de un elemento del microscopio a otro elemento. • Los restos de grasa y piel se eliminan del tornillo micrométrico con una gasa humedecido en éter-alcohol. • La lente del condensador se limpia con una punta de algodón humedecida con éter-alcohol (etanol) en la parte superior. • Las lentes del objetivo también se limpian suavemente con una punta de algodón humedecida en éter alcohol. • Lo mismo se hace con las lentes de los oculares.

Importante No use alcohol solo para limpiar las lentes, ya que deja rayas y anillos molestos en las superficies de las lentes.


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